«МАТЕРИАЛЫ 52-Й МЕЖДУНАРОДНОЙ НАУЧНОЙ СТУДЕНЧЕСКОЙ КОНФЕРЕНЦИИ МНСК–2014 11–18 апреля 2014 г. БИОЛОГИЯ Новосибирск 2014 УДК 15.010 ББК Ю 9 Конференция проводится при поддержке ...»
Таким образом, механизм декомпактизации ДНК в междисках остается непонятным. Одной из возможных причин является нестабильность нуклеосомной укладки в этих районах. Можно предположить, что с ДНК междиска связываются белки, которые или сами способны ремоделировать хроматин, или привлекают ремоделирующие комплексы. Известно, что к таким ДНК-связывающим белкам относятся транскрипционные факторы.
На данный момент исследование зависимости между транскрипционными факторами, нуклеосомной укладкой и декомпактизацией ДНК является крайне актуальным.
Междиск 61С7/C8 был выбран для исследования, так как ранее для него было показано связывание транскрипционных факторов Adf-1, dMyc и DREF на политенных хромосомах слюнных желез. В данной работе мы провели исследование нуклеосомной укладки междиска в слюнных железах линии дикого типа. Хроматин обрабатывали микрококковой нуклеазой с последующей детекцией с помощью Real-Time PCR. По полученным данным можно сделать вывод о зависимости между нуклеосомной укладкой и связыванием транскрипционных факторов.
Научный руководитель - д-р биол. наук С. А. Демаков
ОСОБЕННОСТИ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ
ДНК В РАЗЛИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КОМПАРТМЕНТАХ
Новосибирский государственный университет Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН ДНК – главный носитель генетической информации в клетке – может повреждаться различными агентами физической и химической природы.Воздействиям подвержен не только ядерный, но и митохондриальный геном. По сравнению с ядерным, он более доступен для действия окислительного стресса, опосредованного активными формами кислорода, что объясняется близостью электронно-транспортной цепи.
Эксцизионная репарация оснований (ЭРО) – один из наиболее важных путей репарации ДНК, удаляющий широкий спектр химических модификаций оснований ДНК. Этот процесс инициируется ферментами ДНК-гликозилазами.
Для многих ДНК-гликозилаз (8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза, урацилДНК-гликозилаза, MUTYH и др.) известно существование отдельных ядерной и митохондриальнойизоформ, однако ферментативные свойства неядерных форм остаются малоизученными. В связи с этим цель данной работы состояла вхарактеристике профиля активности ферментов ЭРО ДНК в ядре и в митохондриях клеток человека.
Исследования проводились на двух линиях раковых клеток человека – RPMI-8226 (клетки миеломы) и MCF-7 (клетки аденокарциномы молочной железы). Из клеток этих линий были приготовлены общий, цитоплазматический, митохондриальный и ядерные экстракты, в которых с использованием модельных субстратов была оценена активность ферментов ЭРО.
В ходе работы было установлено, что во всех клеточных компартментах хорошо представленаурацил-ДНК-гликозилазная, АПэндонуклеазная активности и гликозилазная активность окисленных пиримидинов. 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазная и алкиладенин-ДНКгликозилазная активности встречаются в ядре и митохондриях, что согласуется с литературными данными о существовании соответствующих изоформ этих гликозилаз.
Научный руководитель – д-р биол. наук Д. О. Жарков
ОТБОР МЕТОДОМ ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ ПЕПТИДОВ
ИМИТАТОРОВ ЭПИТОПОВ, УЗНАВАЕМЫХ
ШИРОКОНЕЙТРАЛИЗУЮЩИМ АНТИТЕЛОМ VRC
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Проблема создания эффективной вакцины против ВИЧ-1 является одной из важнейших задач современной медицины. Уникальные свойства вируса, такие как ускользание от действия иммунной системы, интеграция в геном, высокая вариабельность препятствуют созданию вакцины.В настоящее время пристальное внимание исследователей направлено на изучение феномена антител, способных нейтрализовать широкий спектр первичных изолятов ВИЧ-1. Считается, что эффективная вакцина против ВИЧ должна индуцировать наработку подобных антител.
Одним из подходов к их изучению является метод фагового дисплея.
Суть метода заключается в создании библиотек пептидов на основе нитчатых бактериофагов путем встройки в их геном рандомизованных нуклеотидных последовательностей, кодирующих пептиды, которые экспонируются на поверхности вириона в составе белков оболочки. Число фагов в библиотеке, экспонирующих различные пептиды, велико и достигает 109 индивидуальных клонов. Из этого многообразия с помощью аффинной селекции можно отобрать пептиды, специфически взаимодействующие практически с любой мишенью.
В рамках данной работы была проведена аффинная селекция пептидов из библиотеки Ph.D–с7с (New England Biolabs, США) с использованием моноклонального антитела широкого спектра действия VRC01, нейтрализующим более 90% первичных изолятов ВИЧ-1. Были отобраны связавшиеся с VRC01 фаги и определен аминокислотный состав экспонированных на их поверхности пептидов. Специфичность связывания выделенных бактериофагов с VRC01 подтверждали с помощью дот-блот анализа. Были выявлены фаги, связывающиеся с VRC01 с наибольшей аффинностью. Рандомизованные пептиды, экспонируемые этими фагами, были химически синтезированы и использовались в анализе конкурентного ингибирования нейтрализующей активности VRC01 c использованием псевдовирусов ВИЧ-1. Некоторые пептиды в разной степени продемонстрировали способность ингибировать реакцию вирус нейтрализации. Это дает основание полагать, что они способны имитировать структуру «нативного» эпитопа VRC01.
Научный руководитель – канд. биол. наук Д. Н. Щербаков
ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИПОФИЛЬНЫХ И
ГИДРОФИЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ, ВВЕДЕННЫХ
В СОСТАВ ЛИПОСОМ
Кемеровский государственный университет Иинститут комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеванийСО РАМН
Структурные особенности липосом превращают их в практически идеальное средство для доставки биологически активных веществ в клетки и ткани. Микроскопические методы исследования внутриклеточного распределения веществ успешны только при введение в состав липосом люминесцентных красителей. Также необходимой частью микроскопического исследования становится люминесцентное окрашивание органелл клетки. Комбинации липофильных, гидрофильных красителей, красителей внутриклеточных структур могут быть различными, поэтому необходимо их адекватное сочетание.Наши эксперименты базировались на изучении внутриклеточного поглощения и распределения люминесцентных красителей, введенных в состав липосом. Исследования проводились на культуре фибробластов крысы. Клетки высевали на покровные стекла, помещенные на дно лунок 6-луночного планшета. Комбинации липосомальных красителей были следующие: липофильный PKH-26 или липофильный TopFluor PC и гидрофильный FITC-Dextran. Митохондрии дополнительно окрашивали MitoTracker Deep Red, ядра красителем Hoechst. Выбранные красители отличались по спектрам экстинкции и эмиссии. Использовали три размера липосом - 50 нм, 100 нм и 1200 нм (МЛВ) Концентрация липосом 1 мг липида/мл, время инкубации 1 час. После фиксации в 4% забуференном параформальдегиде клетки заключали в среду Mowiol. Образцы изучали в люминесцентном микроскопе AxioVision Z.1, с использованием соответствующих светофильтров. На основании внутриклеточной локализации липосомальных красителей показали, что липосомы являются эффективным средством доставки гидрофильных и липофильных веществ в клетки. Выявили колокализацию липосомальных красителей и красителей, селективно окрашивающих органеллы, и это позволило заключить, что выбранные липосомальные композиции локализуются в митохондриях и ядрах. Внутриклеточная локализация липосомальных красителей зависела от размера липосом.
Научные руководители – канд. биол. наук, доцент Р. А. Мухамадияров, канд. биол. наук, доцент Л. А. Варич
АНАЛИЗ ПРОСТРАНСТВЕННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ
МЕТАБОЛИТОВ ВДОЛЬ ЦЕНТРАЛЬНОЙ САГИТТАЛЬНОЙ ОСИ
ХРУСТАЛИКА ЧЕЛОВЕКА
Новосибирский государственный университет Международный томографический центр СО РАН Хрусталик представляет собой уникальную ткань благодаря структуре составляющих его клеток. Однослойный эпителий передней стенки хрусталика состоит из кубических клеток, которые способны делиться на протяжении всей жизни. Клетки более глубоких слоев хрусталика теряют органеллы и ядра для обеспечения прозрачности ткани, удлиняются и плотно располагаются концентрическими слоями, формируя ядро и кору хрусталика. В результате потери клетками структур, необходимых для питания хрусталика и производства незаменимых метаболитов, единственным возможным источником может быть их поставка извне. В настоящее время нет четкого понимания, каким именно образом происходит питание и транспорт метаболитов во внутренние слои хрусталика. Целью данной работы является установление пространственного распределения основных метаболитов относительно центральной сагиттальной оси нормального хрусталика человека.Исследование было проведено с использованием сочетания методов:
масс-спектрометрического, а также высокоэффективной жидкостной хроматографии.
В результате данной работы впервые было определено пространственное распределение двадцати основных метаболитов вдоль центральной сагиттальной оси хрусталика глаза человека, включая антиоксиданты, аминокислоты и УФ-фильтры. Для большинства соединений наблюдается равномерное распределение в исследуемом направлении, что может являться нормальным состоянием для здорового хрусталика. Можно заключить, что насыщение анализируемой области основными метаболитами успевает восполнить их медленное расходование. Однако, GSH – незаменимый антиоксидант хрусталика, препятствующий возникновению белковых сшивок, – демонстрирует постепенное падение концентрации к задней стенке хрусталика глаза человека. Данное наблюдение свидетельствует о том, что GSH поставляется в толщу хрусталика за счет свободной диффузии из эпителиальных клеток хрусталика, где он и синтезируется.
Научный руководитель – канд. хим. наук. Л. В. Яньшоле
КОНСТРУИРОВАНИЕ ОНКОЛИТИЧЕСКОГО
РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА MVA ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ
СО ВСТРОЙКОЙ ГЕНА АПОПТОЗ-ИНДУЦИРУЮЩЕГО БЕЛКА
NS1 ПАРВОВИРУСА
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»Новосибирский государственный университет Один из новых подходов в терапии онкологических заболеваний – это уничтожение раковых клеток неопасными для человека вирусами. Такая терапия имеет ряд преимуществ перед стандартными методами противораковой терапии. Вирусы могут быть быстро модифицированы с применением технологии рекомбинантных ДНК, что позволяет внедрять интенсивно появляющиеся новые знания о канцерогенезе и клеточных сигнальных путях в процесс создания онколитических вирусов.
Вирус осповакцины обладает природной селективностью в отношении малигнизированных клеток человека. В данной работе мы использовали высокоаттенуированный штамм MVA вируса осповакцины, чтобы снизить риск возможных осложнений при терапии раковых больных.
Для усиления адресности и противоопухолевых свойств в геном MVA был введен дополнительный ген, кодирующий первый неструктурный белок NS1 парвовируса крыс Н-1. Белок NS1 является главным фактором, ответственным за специфическую онколитическую активность парвовирусов и способен индуцировать апоптоз раковых, но не нормальных, клеток человека.
Рекомбинантный вариант MVA-NS1 был получен путем трансфекции плазмиды интеграции, несущей ген NS1, в клетки CER, инфицированные вирусом MVA, и последующего отбора рекомбинантных клонов методом временной доминантной селекции с использованием в качестве маркера гена устойчивости к пуромицину. Экспрессия гена NS1 под контролем синтетического ранне-позднего промотора вируса осповакцины показана методом Вестерн-блот анализа. Несмотря на присутствие на N-конце белка лидерного пептида вирусного фактора роста (VGF), рекомбинантный NS не секретировался в культуральную среду и регистрировался только в лизатах инфицированных клеток.
Онколитическая активность штамма MVA-NS1 исследована на культурах раковых клеток человека различного генеза.
Научный руководитель – д-р биол. наук Г. В. Кочнева
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ПРОТЕОМНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКЗОСОМ
КРОВИ ЗДОРОВЫХ ЖЕНЩИН И БОЛЬНЫХ
РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Новосибирский государственный университет Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Актуальность. Поиск в крови маркеров, характерных для онкотрансформированных клеток, является актуальной задачей молекулярной онкологии. Показано, что в кровотоке онкологических больных циркулируют экзосомы, секретируемые клетками опухолей, и содержащие биополимеры, характерные для этих клеток. Таким образом,, исследование протеома экзосом крови онкологических больных позволяет получить новые данные о белках трансформированных клеток и выявить потенциальные белковые онкомаркеры, пригодные для клинической диагностики /мониторинга злокачественных новообразований.Целью исследования является выявление белков экзосом, специфичных для рака молочной железы и последующее исследование диагностического потенциала измерения концентрации этих белков в крови для диагностики злокачественных новообразований молочной железы.
Материалы и методы: Кровь 23 здоровых женщин и 9 больных раком молочной железы была разделена на плазму и форменные элементы крови, элюаты с поверхности клеток крови были получены по разработанному ранее протоколу (Tamkovich S., 2005, Clin. Chem.). Препараты экзосом из плазмы и элюатов с поверхности клеток крови были получены путем фильтрации через фильтры с диаметром пор 100 нм и последующих двух раундов ультрацентрифугирования при 100 000 g в течение 1,5 ч., и охарактеризованы при помощи трансмиссионной электронной микроскопии и окрашивания конъюгатом белка А с наночастицами золота комплексов первичных антител против тетраспанинов на наличие маркеров экзосом CD-9, CD-24 и CD-63. Белки полученных препаратов экзосом разделяли при помощи электрофореза в градиентном ПААГ, мажорные и минорные белки идентифицировали при помощи массспектрометрического анализа.
Результаты. При помощи трансмиссионной электронной микроскопии было показано, что экзосомы диаметром 30-70 нм присутствуют как в плазме, так и на поверхности клеток крови, при помощи иммунохимического окрашивания подтверждено наличие характерных для экзосом антигенов CD-9, CD-24 и CD-63. При помощи 10-20 % SDS-дискэлектрофореза с последующим окрашиванием белков коллоидным серебром было установлено, что в полученных препаратах присутствуют белки с молекулярной массой от 8 до 250 кДа с преобладанием мажорных белков 20, 40, 55 и 100 кДа. Время-пролетная MALDI TOF/TOF и maXis 4G масс-спектрометрия позволила достоверно идентифицировать белков экзосом плазмы крови: цитоплазматический актин, KIAA 0378, нинеины (изоформы CRA-d, CRA-h, 2), цитоспин, -1-синтропин, сывороточный альбумин, -2-макроглобулин, серотрансферрин, эстрадиол-17-дегидрогеназа 12, митохондриальный метил-трансферазноподобный белок 17, карбамоилфосфат синтаза, Serine/threonine- protein phosphatase 4 regulatory subunit, ядерный аутоантиген sp-100, -кристаллин, трансмембранный белок 74B.
Выводы. Показано, что экзосомы циркулируют не только в плазме крови но и будучи связанными с поверхностью клеток крови. Отработаны все технологические этапы работы по получению и характеризации экзосом, протеомному анализу экзосомальных белков. Для достоверного сравнительного анализа белков экзосом онкологических больных и здоровых женщин необходимо продолжить исследование.
Научный руководитель — канд. биол. наук С. Н. Тамкович
«